엔도톡신 시험의 원리

안녕하세요 에마리입니다.

 

이번에는 엔도톡신 시험의 원리에 대해 알아보겠습니다.

 

이전에 말했듯이 엔도톡신은 Gram(-)균의 세포 외막의 LPS(Lipopolysaccharide) 성분입니다. 

 

좀 더 정확하게는 LPS 층의 Lipid A 부분이 발열작용을 일으키는 역할을 합니다.

 

눈에도 보이지 않는 이 성분을 우리는 어떻게 검출해 낼 수 있을까요?

 

투구게의 혈청성분이 이 LPS와 만나게 되면 굳어버리는 화학반응을 일으키는데 이것은 투구게의 입장에서도 오염물질이 몸전체에 퍼지지않기위해 굳게 만드는 자기방어 기작입니다.

 

우리는 이 특징을 이용해 엔도톡신을 검출해 낼 수 있습니다.

 

구체적으로 어떤 화학반응으로 굳게 되는걸까요?

 

반응이 일어나는 원리는 아래와 같습니다.

 

출처 - 식품의약품안전처

화학반응의 연쇄작용(Cascade)으로 일어나게 되는데 좌측 위 엔도톡신에 의해 Limulus Amebocyte Lysate 효소와의 반응이 일어나게 됩니다.

 

오른쪽 상단에 보면 Glucan(세균의 curdlan, yeast의 zymosan, 조류(algae)의 laminarin, fungus의 lentinan 등이 포함)이라고 있는데 이것이 Endotoxin이 아닌데도 반응을 촉진 시킬 수 있는 인자입니다.

 

그래서 정확한 엔도톡신 측정을 위해 시험할때 Glucan은 제거하고 시험을 하거나 엔도톡신 시약중 G factor를 억제하는 성분을 가지고 있는 시약도 있어 그렇게 사용한다면 오차인자를 제거 할 수 있습니다.

 

앞의 Factor로 인해 Preclotting enzyme을 Clotting enzyme으로 바꾸게 되면 Coagulogen이라는 복합체를 형성하게 되어 겔화가 진행됩니다. 이것이 쌓이면서 탁도가 높아져 비탁법으로 검출할 수 있게 되고 이 탁도를 엔도톡신 측정기에서 340nm 파장으로 측정하여 분석합니다.

엔도톡신 측정기

이 Coagulogen이 Coagulin이 되면서 겔화가 진행되며 육안으로도 검출할수 있게 됩니다.

 

반응기작 그림의 왼쪽아래의 비색법은 발색합성기질이 포함된 시약을 사용하는데 coaglugen 해당 아미노산부분에 엔도톡신 시약의 pNA 가 결합하면서 발색을 나타내게 되고 405nm의 파장에서 측정하여 엔도톡신 양을 결정하게 됩니다.

 

이러한 겔화, 탁도측정, 발색측정 세가지 방법으로 엔도톡신의 양을 측정하게 됩니다.